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导读：农业论文：“川西北不同沙化程度草地土壤细菌”研究川西北不同沙化程度草地(未沙化草地、轻度沙化草地、中度沙化草地、重度沙化草地)土壤细菌多样性和群落结构特征，利用Illumina二代高通量测序技术MiSeq对土壤细菌的16S rRNA V3~V4可变区进行测序，研究土壤细菌多样性、物种组成和丰富度，并结合土壤理养分探讨影响细菌群落结构的环境因素，对发挥土壤潜在肥力、了解土壤健康状况，实现该区植被的管理与可持续利用有着重要的意义。

川西北不同沙化程度草地土壤细菌群落特征研究
 

摘要：研究川西北不同沙化程度草地(未沙化草地、轻度沙化草地、中度沙化草地、重度沙化草地)土壤细菌多样性和群落结构特征，利用Illumina二代高通量测序技术MiSeq对土壤细菌的16S rRNA V3~V4可变区进行测序，研究土壤细菌多样性、物种组成和丰富度，并结合土壤理养分探讨影响细菌群落结构的环境因素，对发挥土壤潜在肥力、了解土壤健康状况，实现该区植被的管理与可持续利用有着重要的意义。结果表明：(1)不同沙化草地土壤养分具有明显差异，依次表现为：随着沙化程度的增加，土壤pH值逐渐增加，而土壤有机碳、全氮、全钾、碱解氮和速效磷逐渐降低;(2)不同沙化程度草地土壤样品中共检测到细菌的32个门，65个纲，169个目，优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌(Chloroflexi)、浮霉菌门(Planctomycetes)，主要的优势菌纲为放线杆菌纲(Actinobacteria)、α-变形菌纲(αProteobacteria)、酸杆菌纲(Acidobacteria)、β-变形菌纲(β-Proteobacteria)、浮霉菌纲(Planctomycetacia)，与沙化草地相比，未沙化草地优势菌主要是变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria);(3)随着沙化程度的增加，OUT数目、Chao指数、Ace指数、Shannon指数逐渐减小，其中不同沙化草地土壤细菌覆盖率和Simpson指数差异不显著(p>0.05);(4)冗余分析和Pearson相关性分析表明，土壤pH、土壤有机碳(SOC)和全氮(TN)是土壤细菌群落结构和多样性的主要影响因子。
 

关键词：川西北;沙化;草地;土壤细菌群落
 

中图分类号：X72
 

前言：

微生物是土壤生系统的重要组成，微生物参与碳、氮循环，有机化合物分解以及能量传输、运送等多种过程的维护和调节，是土壤生态系统中最具有生命活力的重要组成部分[1-2]。微生物群落多样性与土壤生态系统的结构、功能密切相关，在维持土壤肥力和土壤生态平衡中发挥着重要作用，其结构和功能对于周围环境条件特别敏感，是土壤变化的重要指示之一[3]。细菌作为微生物中含量最多、丰富度最高的类群，通常占土壤微生物的70%-90%，具有最为丰富的遗传多样性，能有效促进有机质分解、营养物质的释放，参与碳、氮等物质循环过程，维持了生态系统能量流动和物质循环[4-6]。在陆生系统中，细菌利用生产者提供的有机物质和代谢物作为营养来源，分解为简单的无机物，同时这些无机物又是生产者的营养来源。土壤中细菌多样性变化会影响土壤生态过程，例如养分循环等[7-8]。此外，土壤中细菌多样性变化还会受自然和人为因素的影响，例如植被、土壤养分、土地利用方式等。高通量测序作为第二代测序方法，由于无需构建克隆，耗时少，通量高，能够准确全面地反映土壤微生物群落分布特征等优势，已经逐渐取代传统的测序方法[9]。
 

自上个世纪90年代以来，随着我国实施的大规模生态恢复工程，西北地区土地沙化和荒漠化得已遏制，然而从目前的研究成果来看，我国土地沙化的重点工作仍集中在北方干旱、半干旱区域，忽略了对西北地区草地沙化的研究[10]。川西北高寒草原是全国五大牧区之一，地处青藏高原东缘，生态地理位置极其重要，是四川省沙化最严重的区域，过去20(1994-2013)年间沙化总面积增加了28.1%，目前草地面积剩余820余万hm2。随着全球气候变化和人类掠夺式发展(滥垦和乱挖)，导致该区草原植被数量级覆盖度急剧下降，生态环境也极度恶化，退化沙化草地面积也逐年扩大，形成了不同沙化程度的草地类型，这已经严重影响了该区经济的可持续发展和生态安全问题，因此对该区不同沙化程度草地的治理和研究已经迫在眉睫[11-12]。截止到现在，该区沙化草地的研究大部分集中在如何治理及治理措施的则取等方面，在沙化草地退化过程中土壤养分急剧降低，导致微生物功能降低。大量的研究也表明，草地沙化降低了土壤微生物数量和活性，不同沙化程度对土壤微生物群落的影响不同，微生物种类及多寡是土壤质量的重要指标，它们对环境极为敏感，又是恢复环境的先锋，提高了生态系统的缓冲能力，微生物指标已经用来评价退化生态系统中生物群系与恢复功能之间的联系并能为退化土壤恢复提供有用信息[11-12]。目前针对不同程度沙化草地土壤微生物群落特征多样性的具体变化情况尚不明确。鉴于此，本文以典型川西北不同沙化程度草地为研究对象，运用高通量测序技术，研究土壤细菌多样性、物种组成和丰富度，并结合土壤理养分探讨影响细菌群落结构的环境因素，对发挥土壤潜在肥力、了解土壤健康状况，实现该区植被的管理与可持续利用有着重要的意义。
 

1 材料与方法

1.1 研究区概况
 

研究区域位于红原县(四川省西北部)，地处阿坝藏族羌族自治州中部(31°51′-33°19′ N，101°51′-103°23′ E)，属于川西北高原灌丛和若尔盖高原植被地区中的植被小区。该区属高原寒冷地区，沙漠化土地总面积为6915.4 hm2，海拔3210-4857 m，冬季长春秋季短，无夏季，日照充足，寒冷干燥，无霜期40-60 d，昼夜温差大，年平均气温1.1℃，年均降水量753.0 mm，近十年极端最高气温为26℃，极端最低气温为-36℃，日照达2417.9 h，日照率为55%。植被以亚高山草甸为主，沼泽植被占有优势，受高寒气候的影响，该区域以高山草甸土、亚高山草甸土和沼泽土为主，伴有寒漠土和风沙土，近年来风沙土的范围不断扩大。本研究的取样点分布于红原至若尔盖公路旁，该区域不同沙化草地均有所表现。
 

1.2 试验设计
 

2017年8-10月，农业论文对研究区进行初步的资料收集和调查，了解研究区沙化土地分布格局，采样时间为植被生长最旺盛期，根据研究区现状选择不同沙化程度的草地(未沙化草地、轻度沙化草地、中度沙化草地、严重沙化草地)。GPS采集样地经纬度和高程信息，详细记录样地基础环境和物种等指标(表1)。每种沙化草地分别选取3个500 m×500 m的样地，每个样地随机选取1 m×1 m样方15个，进行植物群落样方调查。在每个样方按照五点取样法收取500 g左右鲜土，鲜土过2 mm筛除去大的砾石和根系，取样深度为0-10 cm混合土样(除去表层的枯落物和较多的根系)，充分混匀后液氮保存(-80℃)，带回实验室内用于测定微生物多样性;另一部分自然风干15 d后过80目筛后测定土壤养分含量。
 

样地海拔/m坡向坡度/°坡位群落特征环境条件

未沙化草地

Non-desertification grassland(ND)34982102平均盖度95%以上，物种丰富，平均高度在32 cm土层较厚，较为干燥，人为干扰小

3472692

3468561

轻度沙化草地

Light-desertification grassland(LD)3456383平均盖度65%以上，物种相对丰富，平均高度在25 cm土层较厚，较为干燥，存在放牧

3467662

3408792

中度沙化草地

Middle-desertification grassland(MD)34212131平均盖度30%以上，物种相对丰富，平均高度在20 cm砂粒为主，干燥，有鼠害，重度放牧

34265111

3450453

重度沙化草地

Heavy-desertification grassland(HD)3406382平均盖度10%，物种丰富度低，平均高度在12 cm裸斑较多，干燥，砂粒，人为干扰严重，过度放牧

3427373

3431691

表中用1代表上坡位，2代表中坡位，3代表下坡位。坡向是顺时针旋转的角度来表示(以朝东为起点，为0°)，每45°为一个等级，其变化范围在0-8之间，数字越大，表示越干热[19-20]。
 

1.3 土壤样品的测定

1.3.1 土壤养分的测定
 

一部分土壤样品经自然风干20 d后，去除植物根系等杂物过2 mm筛。土壤pH采用电极电位法(2.5：1水土比浸提液);有机碳和全氮含量采用元素分析仪;速效磷采用NaHCO3浸提-钼锑抗比色法;碱解氮采用NaOH-H3BO3法;全钾采用乙酸铵浸提—火焰光度计法[13]。
 

1.3.2 土壤细菌测序

(1)土壤DNA提取和测序
 

土壤DNA的提取使用上海美吉公司提供的DNA试剂盒(Omega Bio-tek,Inc，Doravilla，GA，USA)利用1%琼脂糖凝胶电泳进行基因组DNA的检测抽提。参照电泳初步定量的结果，使用Promega 公司的QuantiFluorTM-ST 蓝色荧光系统对PCR 产物进行定量检测，之后根据每个样本的测序量要求进行相应比例的混合。利用磁珠纯化后的PCR 产物对目的片段(16S rRNA V3~V4)进行检测。采用上海美吉生物公司提供的MiSeq测序平台，利用细菌的特异性引物(338F_806R)进行16S rRNA 基因扩增，使用AXYGEN 公司的AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，Tris-HCl洗脱;2%琼脂糖电泳检测。下机的原始数据去接头、去污染、去低质量，筛选得到可信数据，根据索引号对比至各个样品。
 

(2)序列的优化及去杂

高通量测序过程中通常会出现一些点突变和高分子均聚物等测序错误，随着测序长度的增加造成序列末端的质量降低，为了得到更高质量及更精准的生物信息分析结果，则应对有效序列进行去杂和修剪得到优化数据。使用软件Trimmomatic、FLSAH对数据进行去杂。
 

(3)生物信息分析及数据处理

根据Barcode 序列拆分各样品数据，然后截取Barcode和引物的序列使用FLASH对进行拼接;高通量序列数据使用QIIME进行数据处理：利用UPARSE软件对全部有效序列进行聚类，默认以99%序列相似度对序列聚类获得OTUs(operational taxonomic units，操作分类单元);从每个OTUs选取一个代表性序列，以Greengenes数据库为参考，使用RDP Classifier对OUT进行物种注释，置信水平为80%;最后对样品数据均一化处理，以样品中数量最少的为标准，统一抽取有效序列来研究细菌群落结构。通过计算物种丰富度(OTUs)和土壤细菌群落多样性。
 

计算细菌丰度(Community richness)的指数如下[14]：
 

Chao指数：是用Chao1 算法估计群落中含OTU数目的指数，Chao1在生态学中常用来估计物种总数，由Chao最早提出。

Ace指数：用来估计群落中含有OTU数目的指数，由Chao提出，是生态学中估计物种总数的常用指数之一，与Chao1的算法不同。
 

细菌多样性(community diversity)的指数如下[15]：
 

Simpson指数：用来估算样品中微生物的多样性指数之一，由Simpson提出，在生态学中常用来定量的描述一个区域的生物多样性，Simpson指数值越大，说明群落多样性越低。

Shannon：用来估算样品中微生物的多样性指数之一。它与Simpson多样性指数均为常用来反映α多样性的指数，Shannon值越大，说明群落多样性越高。
 

测序深度指数如下[16]：

Coverage：是指各样品文库的覆盖率，其数值越高，则样本中序列没有被测出的概率越低。该指数反映了本次测序结果是否代表样本的真实情况。
 

对OTU列表中获得的分类信息与丰度进行整理，在门和纲分类水平下对各样品进行物种丰度统计及冗余分析(RDA)，可得到样品中群落组成结构、相似性以及群落结构与环境因子的关系。