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农业技术论文-鸡马立克氏病疫苗鸡胚免疫技术的应用

　导读：农业技术论文：“鸡马立克氏病疫苗鸡胚免疫技术的应用”通过对起对试验鸡群抽样开展体液免疫检测、细胞免疫检测、病理检测等试验室检测工作得出结论鸡胚免疫技术能有效提高鸡马立克氏病疫苗的免疫效果。

摘要：目的 通过不同的马立克氏病(Marek’s disease，MD)疫苗接种方法的比较，得出获得最佳免疫效果的免疫方法。 方法 选取孵化示范基地，孵化五组试验鸡群，每组100羽，试验组分别采取出生1日龄免疫、18日龄鸡胚免疫、出生免疫+17日龄二免、鸡胚免疫+出生二免、空白对照，自60日龄起对试验鸡群抽样开展体液免疫检测、细胞免疫检测、病理检测等试验室检测工作。结果 与对照组相比，四个疫苗免疫组的血清抗体效价、IFN-γ、IL-4水平均显著升高，同时MD的发病率显著下降，其中，以18日龄鸡胚免疫和鸡胚免疫+出生免疫效果最为显著。结论 鸡胚免疫技术能有效提高鸡马立克氏病疫苗的免疫效果。
 

关键词：鸡;马立克氏病;鸡胚免疫
 

鸡马立克病是由马立克病病毒(Marek’s disease virus，MDV)引起鸡的一种传染性肿瘤病，主要以各组织器官、神经、皮肤及虹膜和性腺形成肿瘤和淋巴组织增生为特征[1]。由于MDV可通过空气传播，且感染的鸡很快发病死亡，给养殖业带来了巨大的经济损失，MD是鸡的重要疫病之一，受到了国内外的重视。MD是目前已知的唯一可用疫苗成功预防的病毒性肿瘤疾病，无特效药物治疗，只能预防。但近年来发现，免疫鸡群往往由于早期感染，导致免疫失败，由于鸡胚发育后期的组织学基础研究[2] 和MD 鸡胚免疫保护效果[3,4] 的研究都表明，鸡胚在孵化后期已具备能够产生一定程度的免疫应答的组织基础。因此，本文用鸡胚免疫并结合常用的免疫方法对试验基地的鸡群进行试验，以期获得最佳的鸡马立克病疫苗免疫方法。
 

1材料和方法
 

1.1试验材料
 

1.1.1种蛋 该试验是以溧阳市南渡宏伟种禽养殖场、南渡仁福养鸡场、南渡福兴苗禽有限公司三家规模种禽养殖(孵化)场为示范基地，共孵化饲养五组试验鸡群，每组100羽。

1.1.2疫苗 试验组均免疫接种鸡马立克氏病Ⅰ+Ⅲ型二价活疫苗(CVI988+FC126株)，按照0.2ml/枚的量接种。

1.2鸡胚孵化 试验所用的鸡胚在孵化之前用甲醛熏蒸消毒30min，37.5℃～38.5℃孵化，湿度62%，每小时翻蛋一次，使用大型电气自动孵化器孵化。
 

1.3试验分组及免疫方法

本项目是在示范基地，孵化饲养五组试验鸡群，每组100羽。试验组分别采取出生1日龄免疫、18日龄鸡胚免疫、出生免疫+17日龄二免、鸡胚免疫+出生二免、空白对照。自60日龄起对试验鸡群采血开展体液免疫检测、细胞免疫检测、病理检测等试验室检测工作。每组随机抽取10羽鸡，通过试验检测数据分析，制定合理的鸡马立克氏病免疫方法并推广应用。

1.3.1 第1组：出生1日龄免疫 刚出生的仔鸡，进行胫部外侧肌肉注射稀释好的鸡马立克氏病Ⅰ+Ⅲ型二价活疫苗0.2ml/枚。

1.3.2 第2组：18日龄鸡胚免疫 孵育至18日龄的鸡胚，用碘酊和酒精消毒鸡卵钝端的气室，6号针头在中央打孔，然后用5号注射器垂直进针，刺入全部针长注射二价活疫苗疫苗0.2ml/枚，最后用石蜡封口，继续常规孵化。

1.3.3 第3组：出生免疫+17日龄二免 将试验组的鸡群在出生和17日龄时均进行胫部外侧肌肉注射二价活疫苗，0.2ml/羽。

1.3.4 第4组：鸡胚免疫+出生二免 孵育18日龄后同上鸡胚免疫，0.2ml/枚;出生一日龄时胫部外侧肌肉进行二免，0.2ml/羽。

1.3.5 第5组：未免疫的对照组。

1.4试验室检测

1.4.1间接ELISA法检测鸡马立克氏病病毒血清抗体

农业技术论文：鸡马立克氏病疫苗鸡胚免疫技术的应用通过对起对试验鸡群抽样开展体液免疫检测、细胞免疫检测、病理检测等试验室检测工作得出结论鸡胚免疫技术能有效提高鸡马立克氏病疫苗的免疫效果。
 

采用商业化的MDV血清抗体间接ELISA检测试剂盒，在酶标板条微孔上预包纯化的鸡MDV的抗原。一定时间后，加入稀释后的待检血清，经过温育后，血清样品中MDV的抗体与包被板上的抗原特异性的结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后;再加入HRP标记的兔抗鸡IgG酶标二抗，与检测板上的抗原抗体复合物发生特异性结合;再经洗涤除去未结合的酶结合物;在微孔中加入TMB底物液，经酶催化形成蓝色产物，加入终止液终止反应后，用酶标仪450nm波长测定反应孔中的吸光度A值。吸光度A值与样品中鸡马立克氏病病毒抗体成正相关。

1.4.2各试验组鸡血清IFN-γ水平检测

IFN-γ由1型辅助性T细胞(Th1细胞)分泌产生，主要参与细胞免疫。因此血清中的IFN-γ水平，可以间接反映试验动物的细胞免疫水平。
 

应用双抗体夹心法测定标本中鸡γ干扰素(IFN-γ)水平。用纯化的鸡IFN-γ 抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入待检血清，再与HRP标记的羊抗鼠酶标抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的IFN-γ呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD 值)，通过标准曲线计算血清样品中鸡IFN-γ浓度。

1.4.3各试验组鸡血清IL-4水平检测
 

IL-4由2型辅助性T细胞(Th2细胞)分泌产生，主要参与体液免疫。因此血清中的IL-4水平，可以间接反映试验动物的体液免疫水平。
 

应用双抗体夹心法测定标本中鸡白介素4 (IL-4)水平。用纯化的鸡IL-4抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入待检血清，再与HRP标记的羊抗鼠酶标抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的IFN-γ呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD 值)，通过标准曲线计算血清样品中鸡IL-4浓度。
 

1.4.4各试验组鸡发病率统计

观察并统计各试验组患有如下典型症状的病鸡的数量。如病鸡一侧腿发生不全或完全麻痹，站立不稳，两腿前后伸展，呈“劈叉”姿势。或精神萎顿，食欲减退，羽毛松乱，鸡冠苍白、皱缩，有的鸡冠呈黑紫色，黄白色或黄绿色下痢，迅速消瘦，胸骨似刀锋，触诊腹部能摸到硬块。病鸡脱水、昏迷，最后死亡。对疑似患病鸡进行病原PCR检测，以确定疾病是由MDV引起的。并采取患病鸡的肝等组织进行病理组织学检查。